生物學(xué)工具真正力量在于探索基因組運(yùn)行方式

　　分子學(xué)家對CRISPR帶來的潛在新技術(shù)掀起新一輪探索。圖片來源：Ryan Snook

　　只要出現(xiàn)一篇關(guān)于CRISPR-Cas9的報(bào)道，Addgene的員工就會(huì)立刻找到它。這家非營利公司是論文作者經(jīng)常儲(chǔ)存研究中使用的分子工具的地方，也是其他科學(xué)家立即獲取這些分子工具的地方，還是一些科學(xué)家可以即刻得到相關(guān)試劑的地方。“一篇熱門論文發(fā)表之后，我們幾分鐘后就會(huì)接到電話。”這家美國馬薩諸塞州坎布里奇市的公司執(zhí)行主任Joanne Kamens說。

　　從2013年年初開始，Addgene公司接到的電話就不斷增多。當(dāng)時(shí)研究人員報(bào)告稱利用CRISPR-Cas9技術(shù)，對所選位點(diǎn)人體細(xì)胞內(nèi)的基因組進(jìn)行了切片。“正是那時(shí)發(fā)出了召集令。”Kamens說。從那時(shí)起，分子生物學(xué)家蜂擁著利用這種技術(shù)—— 一項(xiàng)可史無前例、輕而易舉地用于改變幾乎所有器官基因組的技術(shù)。Addgene目前已經(jīng)向83個(gè)國家的研究人員發(fā)送了6萬個(gè)與CRISPR相關(guān)的分子工具（占其總產(chǎn)品量的17%），2015年，該公司與CRFISPR相關(guān)的網(wǎng)頁閱覽次數(shù)超過1萬次。

　　目前，絕大多數(shù)關(guān)于CRISPR-Cas9的對話都是圍繞其治療疾病或編輯人類胚胎的潛力，但研究人員表示，真正的改革現(xiàn)在正在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。CRISPR可以提供的以及生物學(xué)家所希望的都是“專一性”：在一個(gè)基因組的巨大范圍內(nèi)靶向以及研究特定DNA序列的能力。編輯DNA只是該技術(shù)的一個(gè)可用方面。科學(xué)家正在利用這些工具將蛋白精確地傳遞到DNA目標(biāo)，以打開或關(guān)閉基因，甚至是對整個(gè)生物回路進(jìn)行基因編輯，其長遠(yuǎn)目標(biāo)是了解細(xì)胞系統(tǒng)和疾病。

　　“對于分子生物學(xué)家來說，這的確是非常強(qiáng)有力地了解基因組如何工作的方法。”馬薩諸塞州波士頓兒童醫(yī)學(xué)血液專家Daniel Bauer說。“它的確提升了人們可解決問題的數(shù)量。”南加州大學(xué)分子生物學(xué)家Peggy Farnham補(bǔ)充說，“它蘊(yùn)涵著無窮的樂趣。”

　　近日，《自然》撰文介紹了5種CRISPR-Cas9正在改變的生物學(xué)家編輯細(xì)胞的方法。

　　打破剪切

　　CRISPR-Cas9技術(shù)有兩個(gè)主要成分：一個(gè)是Cas9酶，可以像一把分子剪刀一樣剪切DNA；另一個(gè)是小RNA分子，將“剪刀”引向具體的DNA序列并進(jìn)行剪切。細(xì)胞的固有DNA修復(fù)機(jī)器通常會(huì)修復(fù)剪切，但是經(jīng)常會(huì)發(fā)生錯(cuò)誤。

　　盡管如此，這已經(jīng)給希望擾亂基因以了解其工作內(nèi)容的科學(xué)家?guī)砹烁＠??；蚓幋a是無情的：修復(fù)中間發(fā)生的一個(gè)小小錯(cuò)誤都會(huì)完全改變其編碼的蛋白序列，或是完全停止蛋白生產(chǎn)。因此，科學(xué)家可以在蛋白或基因擾亂時(shí)，研究細(xì)胞或有機(jī)體發(fā)生了什么。

　　但是還有一種不同的修復(fù)通道，有時(shí)也會(huì)根據(jù)DNA模板修復(fù)剪切。如果研究人員有了模板，那么他們就能夠在選擇的幾乎任何位點(diǎn)編輯幾乎任何想要的基因序列。

　　加州大學(xué)舊金山分校系統(tǒng)生物學(xué)家Jonathan Weissman團(tuán)隊(duì)希望了解這種基因編輯工具在剪切人類DNA方面究竟表現(xiàn)如何，但他們打算采用一種不同的方法。“我們做的第一件事是：打破剪切。”Weissman說。該團(tuán)隊(duì)用“死”Cas9嘗試了一些新方法。研究人員將其系在另一個(gè)蛋白的一部分上，該蛋白能夠激活基因表達(dá)。加了幾個(gè)其他扭曲，他們最終讓基因可以根據(jù)意愿打開及關(guān)閉。

　　此后，若干實(shí)驗(yàn)室基于該方法發(fā)表了不同的研究成果。該方法也吸引了麻省理工學(xué)院合成生物學(xué)家Ron Weiss加入CRISPR的研究熱潮。該團(tuán)隊(duì)在一次實(shí)驗(yàn)中建立了多個(gè)基因扭曲，使其可以更快、更簡便地構(gòu)建復(fù)雜的生物學(xué)回路。“合成生物學(xué)最重要的目標(biāo)是能夠通過這些精確的回路構(gòu)建復(fù)雜的行為。”Weiss說。

　　表觀遺傳

　　當(dāng)遺傳學(xué)家Marianne Rots開始其職業(yè)生涯時(shí)，她希望發(fā)現(xiàn)新的醫(yī)療方法，通過基因療法靶向那些疾病變異基因。幾年后，在荷蘭格羅寧根大學(xué)醫(yī)學(xué)中心工作的她決定改變行動(dòng)方向。她認(rèn)為，控制基因活動(dòng)的最佳方法是調(diào)整表觀基因組，而不是基因組本身。

　　表觀基因組是附加在DNA及DNA包裹蛋白化合物（即組蛋白）上的集合體。它們能夠控制DNA通路，打開或是關(guān)閉通向基因表達(dá)的蛋白。而這些標(biāo)記會(huì)隨時(shí)間改變：隨著有機(jī)體發(fā)育及環(huán)境變化，它們會(huì)被添加或去除。

　　過去幾年，數(shù)百萬美元已被投入到這一領(lǐng)域，如計(jì)算不同人體細(xì)胞中的表觀遺傳標(biāo)記以及與大腦活動(dòng)和腫瘤生長相關(guān)聯(lián)的遺傳模式。但是由于沒有能力改變具體位點(diǎn)的標(biāo)記，研究人員就不能決定它們是否會(huì)導(dǎo)致生物學(xué)變化。

　　CRISPR-Cas9將會(huì)扭轉(zhuǎn)局勢。2015年4月，北卡羅萊納州生物工程師Charles Gersbach和同事發(fā)表了一項(xiàng)技術(shù)，利用剪切將乙?；ㄒ环N表觀遺傳標(biāo)記）添加到組蛋白上。

　　Rots曾利用相對較老的基因編輯工具鋅指酶蛋白探索表觀遺傳標(biāo)記的功能，現(xiàn)在她在利用CRISPR-Cas9。“新工具讓這一領(lǐng)域變得民主化，而且已經(jīng)產(chǎn)生了廣泛影響。”她說。Rots表示，人們以前經(jīng)常說，如果重新編寫表觀遺傳基因，并不會(huì)對基因表達(dá)造成影響，或者兩者之間的關(guān)系是巧合。“但是現(xiàn)在測試起來非常簡單，很多人都在加入這一領(lǐng)域。”她說。

　　代碼解密

　　DNA表觀遺傳標(biāo)記并非唯一等待解開的基因代碼。超過98%的人類基因組均未指明蛋白質(zhì)遺傳密碼。研究人員認(rèn)為，大量的DNA發(fā)揮著重要作用，所以他們正在利用CRISPR-Cas9了解代碼是什么。

　　RNA分子的一些編碼，如小分子RNA和小分子核糖核酸和長非編碼RNA，被認(rèn)為與生產(chǎn)蛋白沒有關(guān)系，其他序列是在其指令下擴(kuò)大基因表達(dá)的“增強(qiáng)子”。大多數(shù)與常見疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的DNA序列位于包含非編碼RNA及增強(qiáng)子的基因組區(qū)域。但是在CRISPR技術(shù)之前，研究人員很難了解那些序列在做什么。“我們沒有好方法在功能上解釋非編碼基因組。”Bauer說，“現(xiàn)在，我們的實(shí)驗(yàn)精巧多了。”

　　隨著研究人員利用CRISPR-Cas9技術(shù)探索越來越多的常規(guī)DNA，可能還會(huì)出現(xiàn)更多驚喜。然而，即便是利用CRISPR-Cas9，探索這一未知領(lǐng)域也存在挑戰(zhàn)。Cas9酶能在RNA向?qū)У闹敢录羟行枰庉嫷牡胤?，但這只能是當(dāng)一種具體、常見的DNA序列位于剪切點(diǎn)附近時(shí)。這會(huì)給那些希望讓某個(gè)基因沉默的科學(xué)家?guī)硪稽c(diǎn)難題，因?yàn)殛P(guān)鍵的序列幾乎永遠(yuǎn)存在于該基因內(nèi)部。研究人員正在探索細(xì)菌王國，尋找能夠識別不同序列的Cas9酶的“親族”。

　　去年，麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)下屬博德研究院Feng Zhang實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，一個(gè)叫作Cpf1的酶的家族能夠擴(kuò)展序列選擇。但是Agami強(qiáng)調(diào)，到目前為止所發(fā)現(xiàn)的像Cas9一樣用途廣泛的酶仍然非常少。未來，他希望能夠擁有整個(gè)系列的、可用于靶向基因組中任何位點(diǎn)的酶。“我們現(xiàn)在還沒有到達(dá)那里。”他說。

　　接觸光線

　　Gersbach實(shí)驗(yàn)室正在利用基因編輯技術(shù)作為理解細(xì)胞命運(yùn)以及如何操縱細(xì)胞的部分工具：該團(tuán)隊(duì)希望未來有一天能夠在培養(yǎng)皿中培育出組織，用于藥物檢測和細(xì)胞療法。但是CRISPR-Cas9的作用是永久的，Gersbach團(tuán)隊(duì)需要不時(shí)地打開或關(guān)閉基因，并且要在組織中非常具體的位點(diǎn)進(jìn)行。“模擬血管需要高度的控制力。”他說。

　　Gersbach和同事選擇了不規(guī)則的編輯“剪刀”——現(xiàn)在能夠激活基因的Cas9，并加入了通過藍(lán)光激活的蛋白。當(dāng)細(xì)胞接觸光線后，該系統(tǒng)能夠激發(fā)基因表達(dá)；但沒有光后，系統(tǒng)會(huì)停止基因表達(dá)。由日本東京大學(xué)生化學(xué)家Moritoshi Sato帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)研發(fā)了類似的系統(tǒng)，并且也可以在接觸到藍(lán)光后激活Cas9，實(shí)現(xiàn)基因編輯。

　　通過將CRISPR技術(shù)與化學(xué)“開關(guān)”相結(jié)合，其他人也得到了類似的結(jié)果。紐約威爾康乃爾醫(yī)學(xué)院癌癥遺傳學(xué)家Lukas Dow希望在成年大鼠體內(nèi)產(chǎn)生與癌癥變異相關(guān)的基因，從而復(fù)制出在人類結(jié)腸直腸癌患者中發(fā)現(xiàn)的基因突變。該團(tuán)隊(duì)利用CRISPR-Cas9技術(shù)，通過一個(gè)劑量的脫氧土霉素激活Cas9，從而使其切斷靶向目標(biāo)。

　　疾病模型

　　從癌癥到神經(jīng)退行性疾病等領(lǐng)域的研究人員正在通過CRISPR-Cas9技術(shù)創(chuàng)建疾病動(dòng)物模型。這讓研究人員對更多動(dòng)物、以更復(fù)雜的方式、在更大的范圍內(nèi)進(jìn)行基因編輯。馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院癌癥研究專家Wen Xue正在系統(tǒng)地選擇腫瘤基因數(shù)據(jù)，利用CRISPR-Cas9模擬培養(yǎng)皿以及動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞生長過程中的突變。